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Au XVIe siècle, les Ottomans étaient devenus une menace pour les États d'Europe occidentale. Ils avaient vaincu l'empire byzantin chrétien oriental et saisi sa capitale, devenant la capitale ottomane et les Ottomans contrôlaient une région riche de la Méditerranée orientale, avec des liens avec l'Asie, l'Égypte et l'Inde et au milieu du XVIe siècle, ils gouvernaient un tiers de l'Europe. Les Ottomans avaient créé un empire terrestre et maritime impressionnant, avec des villes portuaires et des connexions commerciales à courte et longue portée. Le grand rival de Charles était Soliman le Magnifique, dont le règne coïncidait presque exactement avec celui de Charles. Un écrivain espagnol contemporain, Francisco López de Gómara, compara défavorablement Charles à Soliman dans les années 1540, disant que bien que riches et poursuivant la guerre, « les Turcs réussirent mieux à réaliser leurs projets que les Espagnols ; ils se consacrèrent plus pleinement à l'ordre et la discipline de la guerre, ils étaient mieux informés, ils utilisaient leur argent plus efficacement ». En 1535, Charles rassembla une force d'invasion de 60 000 soldats et 398 navires des domaines des Habsbourg, de Gênes, du Portugal, des États pontificaux et des chevaliers de Saint-Jean, et il fit envahir cette force à Tunis en Afrique du Nord, d'où les Ottomans et leurs corsaires lançaient plusieurs raids contre les États chrétiens de la Méditerranée. Les Habsbourg détruisirent la flotte ottomane dans le port avant d'assiéger la forteresse de La Goulette.
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Après que les forces des Habsbourg aient conquis la ville de Tunis, elles massacrèrent 30 000 civils musulmans. Le pape Paul III réunit une ligue composée de la république de Venise, du duché de Mantoue, de l'Empire espagnol, du Portugal, des États pontificaux, de la république de Gênes et des chevaliers de Saint-Jean, mais cette coalition fut défaite en 1538 à la bataille de Préveza, et elle fut peu après dissoute. En 1543, François Ier de France annonça son alliance sans précédent avec le sultan islamique de l'Empire ottoman, Soliman le Magnifique, en occupant la ville de Nice sous contrôle espagnol de concert avec les forces turques ottomanes. Henri VIII d'Angleterre, qui avait plus de rancune envers la France qu'il n'en avait contre Charles pour s'être opposé à son divorce, le rejoignit dans son invasion de la France. Bien que les Espagnols aient été vaincus lors de la bataille de Cérisoles en Savoie, l'armée française n’était pas en mesure de menacer sérieusement Milan sous contrôle espagnol, tout en subissant une défaite dans le nord aux mains d'Henry, ce qui la contraignit à accepter des conditions défavorables. Les Autrichiens, dirigés par le frère cadet de Charles, Ferdinand, continuèrent à combattre les Ottomans à l'est. La présence de l'Espagne en Afrique du Nord diminua pendant le règne de Charles, bien que Tunis et son port, La Goulette, aient été pris en 1535.
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L'un après l'autre, la plupart des biens espagnols furent perdus : Peñón de Vélez de la Gomera (1522), Santa Cruz de Mar Pequeña (1524), Alger (1529), Tripoli (1551), Bujia (1554), La Goulette et Tunis (1569).
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==== Conflits avec les princes protestants du Saint-Empire ==== La Ligue de Smalkalde s'était alliée aux Français et les efforts en Allemagne pour saper la Ligue avaient été repoussés. La défaite de François en 1544 conduisit à l'annulation de l'alliance avec les protestants, et Charles en profita. Il tenta d'abord la voie de la négociation au concile de Trente en 1545, mais la direction protestante, se sentant trahie par la position prise par les catholiques au concile, entra en guerre, dirigée par l'électeur saxon Maurice. En réponse, Charles envahit l'Allemagne à la tête d'une armée mixte hollandaise-espagnole, dans l'espoir de restaurer l'autorité impériale. L'empereur infligea personnellement une défaite décisive aux protestants lors de la bataille historique de Mühlberg en 1547. En 1555, Charles signa la paix d'Augsbourg avec les États protestants et rétablit la stabilité en Allemagne sur son principe de cuius regio, eius religio[C'est-à-dire ?], une position impopulaire avec des ecclésiastiques espagnols et italiens. L'implication de Charles en Allemagne établirait un rôle pour l'Espagne en tant que protecteur de la cause catholique des Habsbourg dans le Saint Empire romain ; le précédent conduira, sept décennies plus tard, à une implication dans la guerre qui mettra définitivement fin à l'Espagne en tant que première puissance européenne.
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